L'effet du mycophénolate mofétil sur les podocytes dans la néphrite sérique néphrotoxique

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 14167 (2023) Citer cet article

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Le mycophénolate mofétil (MMF) est utilisé dans les maladies rénales protéinuriques, mais le mécanisme exact de son effet sur les podocytes est encore inconnu. Nos précédentes expériences in vitro suggéraient que le MMF pouvait améliorer les dommages causés aux podocytes via la restauration de l'axe du cytosquelette Ca2+-actine. Le but de cette étude était de caractériser la biologie des podocytes pendant le traitement par MMF dans la néphrite à sérum néphrotoxique (NTS) (NTN). NTN a été induit chez des souris de type sauvage âgées de trois semaines. Au jour 3, la moitié des souris ont été traitées avec du MMF (100 mg/kgBW/j po) pendant une semaine. Au jour 10, nous avons effectué une analyse protéomique des glomérules ainsi qu’une imagerie super-résolution du diaphragme à fente. Pour l’imagerie multiphotonique de la concentration de Ca2+ ([Ca2+]i), le plan expérimental a été répété chez des souris exprimant un capteur de Ca2+ spécifique aux podocytes. Le MMF a amélioré la protéinurie et la formation de croissant induites par le NTS. Nous avons identifié des changements significatifs dans l'abondance des protéines impliquées dans la signalisation du Ca2+ et la régulation du cytosquelette d'actine, ce qui a été confirmé par l'imagerie directe du [Ca2+]i dans les podocytes montrant une diminution des taux de Ca2+ après le traitement par MMF. Ceci était associé à une tendance à la restauration de la structure du processus podocytaire du pied. Nous apportons ici la preuve que le MPA a un effet direct substantiel sur les podocytes. Le MMF contribue à l’amélioration du [Ca2+]i et à l’amélioration du cytosquelette d’actine désorganisé dans les podocytes. Ces données élargissent la connaissance des effets directs des immunosuppresseurs sur les podocytes, ce qui pourrait contribuer à un traitement plus efficace des glomérulopathies protéinuriques avec le moins d'effets secondaires possible.

Les glomérulopathies représentent 5 à 14 % des enfants atteints d’insuffisance rénale chronique et 15 à 29 % des enfants souffrant d’insuffisance rénale dans le monde1. De nombreux patients atteints de glomérulopathies ne peuvent être maintenus en rémission qu’avec un traitement de longue durée aux stéroïdes. Cependant, l’utilisation prolongée de ce médicament entraîne des effets indésirables graves. Par conséquent, les pédiatres en particulier étudient des options thérapeutiques alternatives d’épargne stéroïdienne telles que le mycophénolate mofétil (MMF) dans cette population vulnérable2.

Le MMF, le promédicament de l'acide mycophénolique (MPA) biologiquement actif, agit comme un inhibiteur puissant et réversible de l'IMPDH, l'enzyme clé de la biosynthèse des purines de novo dans les lymphocytes en prolifération, supprimant ainsi les réponses immunitaires à médiation cellulaire et la formation d'anticorps3. La première étude sur les effets rénaux du MMF a montré qu'il prévient le processus de rejet chronique des allogreffes en diminuant l'expression des molécules d'adhésion et des cytokines dans les glomérules, prévenant ainsi la glomérulosclérose4. Au cours des deux dernières décennies, le MMF a été établi et largement utilisé également dans les glomérulopathies inflammatoires5.

Au-delà de son effet immunosuppresseur bien caractérisé, nous savons peu de choses sur la façon dont le MMF agit directement sur le tissu rénal, en particulier sur les podocytes6,7. Dans la néphropathie diabétique, un taux d'apoptose plus faible des podocytes et une expression préservée de la néphrine et de la podocine ont été observés dans le groupe traité par le MMF8. Ceci est conforme aux résultats d'un modèle de puromycine dans lequel l'inhibition de l'IMPDH a restauré le pool d'ATP, qui a conservé l'expression de la néphrine et de la synaptopodine et stabilisé le cytosquelette d'actine9. De plus, Fu et al. ont montré un effet direct du MMF sur une maladie rénale à médiation immunitaire : des souris MRL/lpr ont été traitées avec du MMF. Par la suite, le séquençage d’ARN effectué sur le cortex rénal isolé a montré une diminution significative de l’expression du gène Rac1, qui perturbe la formation des fibres de stress physiologique, lorsqu’il est activé10. Dans le même esprit, nos précédentes expériences in vitro effectuant le séquençage de l'ARN d'une lignée cellulaire de podocytes traités au MPA ont révélé une accumulation des termes « cytosquelette d'actine » et « régulation de la petite transduction de signal médiée par la GTPase ». De plus, les termes « activité des canaux calciques » et « transport des ions calcium » ont également été enrichis11. L’augmentation de la concentration intracellulaire de calcium ([Ca2+]i) dans les podocytes12 peut conduire à une réorganisation aiguë du cytosquelette d’actine, voire à un effondrement du cytosquelette et à une protéinurie13,14,15,16. Dans la présente étude, nous voulions confirmer si le MMF est également capable d'améliorer les dommages aux podocytes via la restauration de l'axe du cytosquelette Ca2+-actine dans un modèle in vivo de néphrite sérique néphrotoxique (NTN).

10 years) in our vivarium. All animal experiments were performed in accordance with relevant guidelines and regulations provided by the LANUV NRW (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen/State Agency for Nature, Environment and Consumer Protection North Rhine-Westphalia). The experimental protocol was examined and approved by the LANUV NRW (VSG81-02.04.2020.A052), which adhered to the 3R principles. Each mouse was considered as n = 1. Altogether 13 mice (5 females, 8 males) constituted the control group, 11 mice (7 females, 4 males) the NTS + veh group and 12 mice (7 females, 5 males) the NTS + MMF group. NTN was induced in three-week old mice (nephrogenesis is already completed, but they are not yet sexually mature) as follows: The animals received intraperitoneal injection of nephrotoxic serum (NTS; Probetex, San Antonio, USA) in a dose of 10 µl/g body weight (BW) on two consecutive days. From a pathogenic point of view, the historically coined term “nephrotoxic” is misleading since the serum induces an immune-mediated process. In detail, nephrotoxic antibodies (heterologous sheep antibodies raised against rat whole glomeruli) are deposited in the whole glomerulus including the subepithelial, subendothelial areas as well as mesangium. Subsequently, mesangial proliferation and crescent formation can be observed. Thus NTN serves as a model for immune-mediated glomerulopathy with proteinuria (Fig. 1a). In our study, all NTS-injected mice showed proteinuria on day 3. Mice without NTS induction served as control. Confounders were not controlled. On day 3, either water (NTS + veh) or MMF (Roche, Mannheim, Germany) in a dose of 100 mg/kgBW/d (NTS + MMF) were administered per oral gavage for seven days. They were then anesthetized with ketamine and xylazine followed by cardiac blood sampling and sacrificed by cardiac perfusion with cold phosphate-buffered saline (PBS). Depending on the further examination technique, mice were additionally perfused with 4% paraformaldehyde. The kidneys were removed and either put in melted agarose for acute kidney slices (AKS) or in 4% neutral buffered formalin for stimulated emission depletion (STED) imaging. Spot urine samples were taken before injection with NTS, on day 3 and the last day. The experimental design is depicted in Fig. 1b./p> 1.5) when comparing NTS + MMF with NTS groups. To clarify molecular functions and biological processes affected by MMF-regulated proteins, we performed Gene Ontology (GO) analyses. Figure 3 depicts a selection of significant GO terms. From the enrichment analysis, we could outline two major groups of terms that were of particular interest: Ca2+ signaling and regulation of actin cytoskeleton (Fig. 3a, b). Of the numerous identified proteins with a p value < 0.05 (Supp. Table 3), we analyzed the ones related to Ca2+ signaling and/or actin cytoskeleton regulation displayed as a heat map (Fig. 4a, b). Additionally, the distribution of the most relevant proteins for Ca2+ signaling and actin cytoskeleton regulation are shown in volcano plot (Fig. 4c). For Ca2+signaling, two proteins attracted our interest (Supp. Table 3). Wbp2, which leads to Ca2+ influx from the ER into the cytoplasm. In addition, Stim2, which is responsible for the Ca2+ influx from the extracellular into the intracellular fluid. Both were significantly down-regulated in NTS + MMF mice compared to NTS + veh group. In line with that, we detected significant changes in the expression of Ca2+-dependent proteins such as Cpne1, Cpne4, Cpne8, Fbln1, Fbln2 and Rasgrp2 (Supp. Table 3). Another group of altered proteins was involved in the regulation of the actin cytoskeleton. The protein expression level of several positive regulators for the Rac1 such as Micall2, Dock7, Trio and Fgd5 were highly down-regulated in NTS + MMF vs. NTS + veh group (Supp. Table 3). The significant reduction in the expression level of the down-stream protein Wasf2 also points in this direction (Supp. Table 3). Additionally, we found the expression level of Arhgap29, a positive regulator for RhoA, highly up-regulated (Supp. Table 3). It was in line with the increased protein level of Spn and Eif5a, which are known to promote stress fiber formation (Supp. Table 3). Finally, we observed a decreased expression level of the lamellipodia inducing Shank3 (Supp. Table 3)./p>|0.58|) altered proteins from the glomeruli proteome analysed using the ShinyGo Gene Ontology (GO) Enrichment Analysis. Panel (a) shows the comparison between NTS and control mice (NTS effect). Panel (b) shows the comparison between NTS + MMF and NTS + veh mice (therapy effect). On the left: the lollipop graphic of altered GO Molecular Functions; on the right: network analysis of the altered GO Molecular Functions. Controls n = 4; NTS + veh n = 4; NTS + MMF n = 6; NTS: nephrotoxic serum; MMF: mycophenolate mofetil./p>

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